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单克隆抗体(McAb)制备注意事项

 (一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。

 (二) 免疫方案

1 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。

2 免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。

3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。

(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。浓度越高，对细胞

的毒性越大。以40%～50%的浓度为宜，pH值以80～82促融率最高。PEG对细胞的毒性，还随分子量增大而加大，分子量1000～4000之间，效果较好，不同牌号的PEG甚至同一厂家不同批次的产品其毒性及促融率也不一样，应预先进行试验。

(四) 操作中的污染污染是杂交瘤技术中最常遇到的问题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。所以对所用试剂、器材、环境要根据其要求进行彻底的消毒灭菌。要严格无菌操作。发现污染及时处理，避免污染扩大，如果一旦发现某一培养板或培养瓶污染时，要及早废弃，一般的处理方法不能有效地控制污染的扩散。如有价值的阳性株被污染时，要设法挽救，可将孔壁上细胞吹打下来，配置于05ml生理盐水中，注射于7～8天前已腹腔注射石蜡油或降植烷的同系小鼠腹腔内，经过小鼠腹腔内培养，微生物可被腹腔内的巨噬细胞吞噬掉。取出的阳性细胞，继续用培养瓶传代培养。

(五) 融合后的克隆株不生长有时遇到融合的细胞不生长或开始的头几天生长，以后细胞逐渐萎缩，甚至在HAT培养基中死去。这种现象的原因很多，如培养液偏碱，影响细胞发育；HAT培养基中的A过多，对细胞毒性大；HT含量不足，不能为融合细胞提供足够的营养；培养箱内CO2不足，湿度不够；另外瘤细胞株的好坏也是影响融合成败的关键因素，所以一定要选用生长良好的瘤细胞供融合用。如发现克隆不生长或生长缓慢时，除检查上述因素并予以纠正外，还应向此孔内添加小鼠饲养细胞，一般其状况能得以改善。