鼎国DNA探针/原位杂交检测试剂盒（经典型）
（生物素标记探针，HRP检测系統）
一  简介
本公司DNA探针杂交原位杂交检测试剂盒依探针标记分为：地高辛原位杂交检测试剂盒、生物素原位杂交检测试剂盒；依检测系统可分为：HRP显色原位杂交检测试剂盒、AP显色原位杂交检测试剂盒；依操作方法可分为经典型试剂盒、超敏型试剂盒。详情请见目录P4～P5，或与本公司技术部联系。

二  试剂盒组成：
10×蛋白酶K溶液  2ml
杂交液(2×) 3ml
去离子甲酰胺 3ml
生物素标记阳性对照探针 50ul
封闭蛋白液 50ml(20×)
Strep－HRP     6ml    
  
三  标本制备
一）取材
1  组织应尽可能新鲜，一般新鲜组织和培养细胞应在30min内固定。
2  所用器械、容器都要经高压消毒，或清洁后用DEPC处理水清洗。
3  要避免用RNA酶很丰富的手指直接接触组织、器械、容器和溶液等。
二） 固定
1  进行原位杂交时，组织常需用化学固定剂固定。其目的在于避免组织中核酸的降解，保存组织的形态结构，以及增加组织的通透性。
2 对新鲜组织的冰冻切片或细胞培养标本先用0.5～1%多聚甲醛固定1min，随后再用70%酒精固定1min。
3 在大多数情况下，4%多聚甲醛都可获得较好的原位杂交结果。因此实验中要选用各种固定剂时，可首先选用4%多聚甲醛。

选用4%多聚甲醛做固定剂，鼎国生物实验室推荐固定时间如下：
        细胞：室温固定30min；
        组织：室温固定1小时。

三） 标本制备
1 常用的原位杂交标本有石蜡切片，冰冻切片和细胞培养标本。
2 所用的载玻片要清洗干净，使其不含RNA酶。为防止组织或细胞标本在杂交过程中脱落，载玻片要用粘片剂处理。（鼎国生物有售粘片剂及处理好的原位杂交专用玻片）。
3 切片厚度可根据具体情况而定。如果靶组织中待测mRNA的量较少，所采用的原位杂交技术敏感性较低，为了能在局部得到较多的信号，切片可厚一些（约10～15微米）；反之，切片则可薄一些（约5～7微米）。
4 制备石蜡切片，展片时要用含0.04% DEPC双蒸水，一般都要用加温台展片。制成的石蜡切片置于52℃烤箱过夜，随即可用来做原位杂交。经烤干的切片也可以室温下保存。
5 冰冻切片置37℃干燥4小时或过夜后，即可进行原位杂交。也可将切片放在盛有干燥剂的密闭容器内－70℃保存一年，或将切片浸在70%酒精内4℃保存一年。
6 培养细胞标本制备采用细胞离心法。标本经空气干燥1～2分钟，浸渍固定，接着用PBS洗两次，每次5分钟；再用热蒸馏水洗2次，每次5分钟。置37℃温箱4小时或过夜，标本即可进行原位杂交。也可－70℃干燥保存或70%乙醇4℃保存。

四  杂交前处理
1  脱蜡：标本先入二甲苯37℃，30min；再转入新鲜的二甲苯，室温10min；然后经浓度逐渐下降的梯度酒精入水。
2 去污剂处理：
a）脱蜡后切片先用PBS洗2次，每次3分钟；接着将切片浸入含0.2% Triton X-100的PBS内15分钟，再用PBS洗两次。
b） Triton X-100的工作液浓度范围可以在0.01～0.3%。
c） 过度的去污剂处理不仅会影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
3 冰冻切片和培养细胞经固定、贴片后直接进行如下操作。

五 操作步骤：
一）试剂制备：
1. 杂交液制备：用户如果没有特殊要求，可将去离子甲酰胺和2×杂交液混合即可。

2. 蛋白酶K：用户实验之前将10×Proteinase K 0.1ml/支分装，－20℃保存，用时取1支用无菌双蒸水10倍稀释使用，4℃保存一个星期。
3. 蛋白封闭缓冲液：用无菌蒸馏水将50 ml蛋白封闭液稀释成1000ml，4℃保存，有时有沉淀析出，不影响性能。

二) 探针制备
 1  本公司出售标记好的探针，探针浓度为20ng/ul，用户可按下列步骤在高
压无菌管中制备DNA探针/杂交工作液：1份探针加9份杂交液。
2  用户自备探针，可将探针稀释成20ng/ul，然后按上面方案混合。

三）杂交和检测：
A. 预处理
1.  切片于37℃下孵育5min使其完全干燥，用新鲜配制的0.5%H2O2/甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3遍。
2.  每片滴加2~3滴1×Proteinase K，37℃孵育20~30min。
3.  PBS洗3次×5min，蒸馏水洗1次。

B. 杂交
A) RNA原位杂交
1  生物素标记DNA探针在95℃下变性5min，然后立即冰浴，按探针制备比例按1:9和杂交液混合。
2  每张切片加1滴DNA探针/杂交工作液，加盖玻片（可用Parafilm膜代替）。＊不要留有气泡。
3  切片放入烤箱中70℃，5~10min，以使RNA变性。
4  将切片放入湿盒中，42℃，4~8小时(杂交过夜最好，但杂交时间最长不许超过24小时)。
5  揭掉盖玻片或Parafilm膜，30~37℃左右水温2×SSC洗涤5分钟×2次，0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×2次。
6  滴加封闭液：37℃　30min，甩去多余液体，不洗。
7  滴加1滴Strep－HRP，37℃（20~60min），0.5ml PBS洗片(5min×4次)。         ＊小心擦拭多余液体。
8  DAB显色：使用DAB工作液1～2滴，加至标本上，一般显色20~30min。若无背景出现可继续显色，充分水洗。
9. 必要时苏木精复染，充分水洗。
10. 酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2).DNA原位杂交
1. 按“探针制备”配制DNA探针/杂交工作液。
2. 在组织切片上滴加一滴DNA探针/杂交工作液，盖上一张盖玻片或Parafilm膜。
3. 将上述切片放在烤箱中或加热箱中，95℃条件下8~10min以使DNA变性。
4. 以下步骤同RNA原位杂交4~11。