银  染  试  剂  盒
一、试剂盒组成：
 亲和硅烷溶液     10 毫升
 硝酸银       2 0克
 剥离硅烷      15 毫升
 37%的甲醛      60毫升
 硫代硫酸钠        10毫升（浓度为10毫克/毫升）

二、测序板和测序胶的制备
 测序用玻璃板必须彻底洗净。先用温水和洗涤剂洗净，用水洗掉洗涤剂，再用去离子水冲洗干净。最后用乙醇洗板。残留的洗涤剂会导致背景增高。
 短玻璃板要经过亲和硅烷处理，以防测序胶从玻璃板上脱落。

（一）短玻璃板的处理
每次铺胶前均需用亲和硅烷对短玻璃板进行处理。
1、 用镜头纸蘸取新鲜配制的亲和硅烷溶液(~1ml)，涂在短玻璃板上。要将整块板都涂满.
2、 4～5分钟后，用95%乙醇洗短玻璃板三次，以去除多余的亲和硅烷。

（二） 长玻璃板的处理
每次铺胶前均需用剥离硅烷,对长玻璃板进行硅化处理。
1、 处理长玻璃板前先更换手套，以防与亲和硅烷交叉污染。
2、 用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液(~1.5ml)，涂在长玻璃板上。要将整块板都涂满。
3、 5～10分钟后，用镜头纸擦去多余的剥离硅烷。
如果玻璃板污染了亲和硅烷，可以在10%NaOH中浸泡30～60分钟。

（三） 测序胶的制备
用含7M尿素的TBE缓冲液配制4～6%聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：亚甲基双丙烯酰胺=19：1）。胶厚度为0.4毫米。
*注意：
1、 使用新配制的丙烯酰胺溶液。
2、 胶厚度小于0.4毫米时会导致信号减弱。
3、 胶厚度大于0.4毫米或丙烯酰胺浓度大于6%时胶易裂。

 三、银染过程
自备材料：
   固定/终止液
   染色液
   预冷反应液
      摇床
2～3个高密聚乙烯塑料浅盘，比玻璃板稍大。（染色用）
  染色过程应在塑料浅盘中进行，建议使用至少两个与玻璃板大小相近的塑料盘。使用前用超纯水将塑料盘清洗干净。

（一） 试剂的配制
按下述配方配制
1、固定/终止溶液（10%冰乙酸）：将200毫升冰乙酸加入到1,800毫升超纯水或双蒸水中。现用现配，不要反复使用。
2、染色溶液：2L超纯水中加入2克硝酸银和3毫升37%甲醛。
    3、反应液：2L超纯水中加入60克无水碳酸钠(用户自备)，冰浴中冷却至10℃。使用前加入3毫升37%甲醛及400微升硫代硫酸钠（10毫克/毫升）。
4、染色步骤：
（1）将长、短玻璃板分开：电泳结束后，用一个塑料棒小心地将长、短玻璃板分开。聚丙烯酰胺凝胶应粘在短玻璃板上。
（2）固定胶：将粘着聚丙烯酰胺凝胶的短玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定/终止溶液，使粘着胶的玻璃板浸泡在固定/终止液中。将胶在摇床上摇动 20分钟或至电泳示踪染料消失。胶可以在固定/终止液中静置过夜。收集固定/终止液，以备下面步骤8中终止染色反应用。若此时反应液尚未冷却，可放入冰浴中致冷。
（3）洗胶：在摇床上用超纯水洗胶三次，每次2分钟。每次洗完后将粘着胶的玻璃板取出沥干10～20秒，再进行下一次洗涤。
（4）染色：将粘着胶的玻璃板移至染色液中，在摇床上摇动30分钟。
a）此时完成反应液的配制：在已冷却至10℃的碳酸钠溶液中加入3毫升37%甲醛及400微升硫代硫酸钠（10毫克/毫升）。往塑料浅盘中倒入预冷的反应液1升，放在一边。其余的反应液体仍放在冰浴中。
b）将胶从染色液中取出，放在一边。染色液回收到烧杯中。塑料盘清洗后加入超纯水。
*注意：漂洗后，胶从超纯水中取出到放入反应液中，这两步之间的时间间隔非常重要。这段时间不能超过5～10秒。漂洗时间过长，会导致信号变弱，甚至没有信号。
（5）洗胶：将胶浸入超纯水中、取出沥水、立即放入盛有预冷反应液的塑料盘中。胶从超纯水中取出到放入反应液中的时间不能超过5～10秒。
（6）显色反应：胶在摇床上摇动至出现模板带或可见第一条带。将胶转至剩余的1升预冷的反应液中，继续显色2～3分钟或至全部条带显现出来。
*注意：正在显色的条带很浅。如果显色时间延长，背景会增强。早终止显色反应好于胶过度显色。胶干后或用APC胶卷曝光后，条带会变黑。
（7）终止显色反应：往反应液中加入1升固定/终止溶液，在摇床上反应2～3分钟，终止显色反应。时间过长会使条带褪色。
（8）洗胶：用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶两次，每次2分钟。
（9）干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干。在可见光下观察；也可以将置于白色或黄色背景下观察。若要长期保期实验结果，可以用APC胶卷曝光。所有反应液均应按规定处理掉。

*注意：银可以从废液中回收，方法是：用约10克NaCl沉淀银，过滤或利用重力获得氯化银沉淀。