本方法利用6聚体随机引物在Klenow酶作用下体外合成线性DNA双链，从而使DNA模板掺入Bio，此方法适用于标记片段在200bp以上的DNA片段。

试剂盒组成:

1. 溶液A（标记缓冲液 10×）	150ul	2. 溶液B（dNTPs(0.5mM)）	100ul
3. 溶液C（dTTP(1mM)）	30ul	4. 溶液D（Bio-16-dUTP,1mM）	30ul
5. 溶液E（随机引物）	30ul	6. 溶液F（Klnow enzyme）	150u(5u/ul)

标记反应:

1. 用无菌水或 TE 缓冲液, 溶解DNA模板，使DNA模板浓度在50ng/ul左右，

   取50-100ng模板加 1ul随机引物混合， 95-100℃变性2分钟，快速冰浴。

2. 按下列方式加入各种试剂:

名  称	体  积
标记缓冲液	5ul
dNTPs(500uM)	3ul
dTTP(1mM) 变性DNA模板（“1”液）	1ul 50-100ng
Bio-16-dUTP	1ul
Klenow 酶(5u/ul)	1ul

3. 加入无菌水，使终积为50ul, 混匀，离心数秒，室温反应60分钟。

4. 95-100℃变性2分钟，迅速冰浴。

5. 可-20℃保存，亦可直接加入杂交液中反应。

注意事项:

1．  配各种试剂均要在冰上操作，Klenow 酶 必须-20℃放置，用时取出，用完立即放入冰箱。

2．  反应模板量在50ng-100ng 最佳，不宜过多。

   3. 室温反应60分钟，如果时间充分，可反应过夜。