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本方法利用6聚体随机引物在Klenow酶作用下体外合成线性DNA双链，从而使DNA模板掺入32P，标记效率最高可达＞1×109cpm/μg,标记效率取决于DNA模板质量和反应条件，此方法适用于标记片段在200bp以上的DNA片段。
试剂盒组成:
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1.溶液A(标记缓冲液 10×） |
150ul |
2.溶液B [dATP(1.5mm)] |
40ul |
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3.溶液C [dCTP(1.5mm)] |
40ul |
4.溶液D [dGTP(1.5mm)] |
40ul |
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5.溶液E [dTTP(1.5mm)] |
40ul |
6.溶液F（六聚体随机引物） |
30ul |
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7.溶液G（Klenow 酶） 150u(5u/ul) |
标记反应:
1. 用无菌水或TE 缓冲液溶解DNA模板，使DNA模板浓度在25ng/ul左右。取25-50ng模板加1ul随机引物混匀，95-100℃变性5分钟，快速冰浴。
2. 按下表加入各种试剂:
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名 称 |
体 积 |
终浓度 |
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标记缓冲液（溶液A） |
5ul |
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dNTPs(500uM) |
2ul |
20 uM each |
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变性DNA模板(“1”液) |
25－50ng |
500 ng/ml |
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α-32P dNTP |
3-5ul |
10 uCi/ul |
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Klenow 酶(5u/ul) |
1ul |
100 u/ml |
3. 加入无菌水，使终积为50ul, 混匀，离心数秒，室温(20-37℃)反应60分钟。
4．95-100℃变性2分钟，迅速冰浴。
5．可-20℃保存，亦可直接加入杂交液中反应。一般情况下此标记探针不需进一歩的纯化
注意事项:
1．1.dNTPs 的改制:各取三种dNTP 1ul,混匀，终浓度即为500uM每种（取哪三种dNTP视用何种同位素而定,如同位素若用α-32P dCTP,则三种dNTP用dATP,dGTP,dTTP）。
2．配各种试剂均要在冰上操作，Klenow ezyme 必须-20℃放置，用时取出，用完即立即放入冰箱。
3. 反应模板量在25ng-50ng 最佳，不宜过多。
4. 同位素用量视用户对标记效率的要求而定，但不要超过这个范围
5. 室温反应60分钟，如果时间充分，可反应过夜。 |