|
本试剂盒适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR 检测，反转录反应体系为20ul，PCR反应体系50ul，通用引物为Beta-actin,扩增片段大小为540bp，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书。
试剂盒组成：
|
名 称 |
浓 度 |
体 积 |
|
1．溶液A（随机引物(RP)） |
50ng/ul |
55ul |
|
2．溶液B（dNTP） |
10 mM |
110ul |
|
3．溶液C（Taq 酶） |
2u/ul |
55ul |
|
4．溶液D（5×RT 缓冲液） |
|
220ul |
|
5．溶液E（酶混合液） |
|
55ul |
|
6．溶液F（10×PCR 缓冲液） |
|
280ul |
|
7．溶液G（DEPC-ddH2O） |
|
1.5ml×2 |
|
8. 溶液H（通用引物,含上，下游引物） |
50ng/ul |
55ul |
|
|
|
|
实验操作:
一、RT 反应：
1．取1-5ug Total RNA或0.2-1ug poly(A)+mRNA(总体积小于13ul)于一支0.2或0.5ml离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。
2．在上面离心管中按下表配制20ul反应体系：
组成 数量
溶液A（随机引物(RP)） 1ul
溶液B（dNTP ） 1ul
溶液D（5×RT buffer） 4ul
溶液E（酶混合液） 1ul
RNA、mRNA样品 Xul
用溶液G补足： 20ul
3. 室温放置10分钟，37 ℃保温30分钟。
4．95℃ 5分钟，4℃ 1-5分钟，可接着进行如下操作也可迅速放入-20℃长期冻存。
二、PCR反应：
1． 按下表制备50ul PCR反应:
组成 数量
RT反应产物 4-8ul
溶液F（10×PCR buffer） 4.5ul
溶液B（dNTP ） 1ul
上游引物（用户自备） 50pmol
下游引物（用户自备） 50pmol
或溶液H（通用引物） 1ul(阳性对照)
溶液C（Taq 酶） 1ul
用溶液G补足： 50ul
2． 离心数秒，上PCR仪扩增，琼脂糖观察结果。
3． 阳性对照推荐使用扩增参数如下：
94℃ 预变性2分钟
94℃ 变性 45秒
55℃ 复性 45秒
72℃ 延伸 45秒
扩增30轮
72℃延伸加时 5分钟
4℃保存
试剂盒说明：
1. 储存：-20℃冻存，至少稳定6个月。
2．用户所使用离心管、吸头均需经过DEPC处理并高压灭菌。
3. 酶混和液含逆转录酶、RNA酶抑制剂。
4. 总 RNA若有轻微降解，目的基因同样能扩增出来。
5. 试剂盒所帯PCR引物能扩增大多数动物的β-actin基因,如：人、猪、羊、兔、鼠、狗等。
附录：DEPC处理的常规耗材
|
编号 |
品名 |
规格 |
产地 |
价格 |
|
K114 |
10μl短吸头 |
96 个/盒 |
自产 |
35.00 |
|
K115 |
10μl长吸头 |
96 个/盒 |
自产 |
35.00 |
|
K116 |
200μl透明 |
96 个/盒 |
自产 |
35.00 |
|
K117 |
1ml透明 |
96 个/盒 |
自产 |
35.00 |
|
K118 |
0.5ml无刻度 |
200个/盒 |
自产 |
50.00 |
|
K119 |
0.5ml有刻度 |
200个/盒 |
自产 |
50.00 |
|
K120 |
1.5ml有刻度 |
100个/盒 |
自产 |
35.00 |
|
K121 |
2.0ml有刻度 |
100个/盒 |
自产 |
45.00 |
|
K122 |
50ml高速离心管 |
10 个/盒 |
自产 |
60.00 |
|
|
|
|
|
|
|
SC009 |
DEPC水 |
100ml |
自产 |
150.00 | |