组成:
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1.溶液A(RNA 变性液<4N异硫氰酸胍,20mM NaAc PH5.2,
0.1Mβ-巯基乙醇,0.5%十二烷基肌氨酸钠>): |
60ml |
-20℃ |
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2.溶液B(氯仿): |
6ml |
4℃ |
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3.溶液C(抽提液<酚:氯仿:异戊醇=24:24:1>): |
60ml |
4℃ |
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4.溶液D(3M NaAc(PH5.2)): |
3ml |
4℃ |
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5.溶液E(水): |
3ml |
4℃ |
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6.溶液F(水):(配75%乙醇用) |
10ml |
4℃ |
实验步骤:
1.a)血清或骨髓样品,可分离白细胞,留取107白细胞。
b)培养细胞可收集107细胞,充分震荡。
c)组织细胞直接取100mg,在电动匀浆器中将其匀浆或液氮研磨。
2. 向样品管中加入2000ul裂解液,充分震荡,使沉淀完全溶解。
3.≥12000rpm 离心5分钟,弃沉淀。
4. 加200 ul氯仿充分混匀,12000rpm离心5分钟。
5. 小心吸取上层水相,加入等体积抽提液,温和混匀,12000rpm离心3分钟。
6. 重复步骤5一次。
7. 吸取上清,加1/10体积3N醋酸钠(PH5.2),1倍体积的异丙醇,-20℃放置
20分钟至1小时。
8. 12000rpm离心10分钟,弃上清,
9. 加入500ul 75%的乙醇,振荡混匀 12000rpm离心10分钟,弃上清。
10. 重复步骤 9
11.室温晾干,约30分钟或4℃冰箱过夜。
12.加入约50ul 水溶解。
13.测OD值计算RNA含量。
14.RNA电泳,紫外灯下可清晰可见18S,28S RNA带。
试剂盒说明:
1 本试剂盒可于-20℃稳定保存一年有效。
2 本试剂盒提取RNA为细胞总RNA,纯度能达到分子生物学各种要求
3 细胞量不宜过多,如需大量提取RNA,可按比例相应扩大RNA裂解液的量.
4 只用本试剂盒所带水.
5 组织每增加100mg,相应试剂要增加一倍。
6所用耗材均DEPC水处理,所用玻璃器皿均需180℃烘烤8-12hr,方能消除RNase的污染。
