一、简介
●适用于测定动、植物、微生物基因组DNA 多态性。
1、组成：DNA快速提取系统（国外试剂盒不配），AFLP核心试剂，AFLP引物。
2、试剂盒自带2000u Taq酶（国外试剂盒不带），使用过程中如Taq酶不够，用户须自己购买。
3、AFLP对DNA质量要求高,本试剂盒赠DNA提取系统，所提DNA质量符合AFLP要求。
4、酶切连接一步完成（本公司独有），有利于用户操作，结果更加可靠。
5、比国外同类产品价格低二分之一，性能优于国外同类产品。
本公司另有其它AFLP试剂盒：PstI/MseI型,EcoR I/MseI型,PstI型
本公司有AFLP电泳所需的测序电泳槽，分大中小三种。
本公司另有制胶所需的亲和硅烷和剥离硅烷，系本公司自行开发产品，主要原料均系进口试剂，经本公司实验室长期应用，效果甚佳。
本公司经销RAPD引物及配套试剂。
二、试剂盒组成；
一）DNA提取系统
溶液A 30ml 5N异硫氰酸胍
溶液B 70ml 4N NaClO4 PH5.2
溶液C 2.6ml Resin用时充分混匀
溶液D 30ml 洗液(用前加入45ml无水酒精,充分混匀)
溶液E 10ml TE buffer
二） AFLP核心试剂
HindIIII/Mse I 100μl 10×Reaction butfer 250μl
（4u/μl每种） 10mM ATP 250μl
adapter 50μl T4 DNA Ligase（3u/μl） 50μl
genomic DNA（50ng/μl） 20μl Pre-amp primer 50μl
dNTP 2ml
AFLP-Water 10ml
AFLP-TE 10ml
10×PCR buffer 10ml
Taq 酶（2u/μl） 2000u
三）AFLP引物
HindIII primers（5ng/μl）
Primer H-AAC 200μl
Primer H-AAG 200μl
Primer H-ACA 200μl
Primer H-ACT 200μl
Primer H-ACC 200μl
Primer H-ACG 200μl
Primer H-AGC 200μl
Primer H-AGG 200μl
Mse I primers（30ng/μl）
Primer M-CAA 200μl
Primer M-CAC 200μl
Primer M-CAG 200μl
Primer M-CAT 200μl
Primer M-CTA 200μl
Primer M-CTC 200μl
Primer M-CTG 200μl
Primer M-CTT 200μl
三、操作步骤
一）基因组DNA提取
1、组织要新鲜，尽可能嫩，长期保存样品需液氮或-70℃以下冰箱。
2、本方法0.2g组织可提取约20ug纯DNA，因此组织最好在0.05-0.1g左右即可。
3、称取0.05-0.1g组织，液氮研磨，然后装入1.5ml离心管内，加入500μl溶液A，反复混匀，室温5-10min。
4、8000rpm,离心5min,去沉淀。
5、将上清转入另一1.5ml离心管，加入800μl溶液B，反复混匀，室温5-10min，
6、加入50μl溶液C（用前振荡混匀）混匀，室温5-10min。
7、≥8000rpm离心60S，弃上清。
8、加入400μl溶液B，混匀，≥8000rpm离心1min，弃上清。
9、加入500μl溶液D，室温混匀，≥8000rpm离心30-60S，弃上清。
10、重复步骤“9”。
11、≥12000rpm离心30-60S，吸干上清，室温晾干约10min。
12、取溶液E 100μl混匀，40-50℃ 1-5min。
13、≥12000rpm离心30-60S，取上清，即为DNA。
14、0.8%琼脂糖检测DNA纯度、完整性及产量，1μl电泳可见即可。
注：0.1-0.2g组织可用100μl溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300μl，此时DNA浓度大约为100ng/μl。
二）限制性酶切及连接
在0.5ml离心管中加入
对照 样品
对照模板DNA 4（50ng/μl）
DNA模板(浓度:1μl电泳可见即可,或50ng/μl) 4μl
adapter 1μl 1μl
HindIII/Mse I 2μl 2μl
10XReaction buffer 2.5μl 2.5μl
10mM ATP 2.5μl 2.5μl
T4 Ligase 1μl 1μl
AFLP-Water 7μl 7μl
混匀离心数秒 37℃保温5hr ,8℃保温4hr, 4℃过夜.
三）预扩增
1、在0.5ml或0.2ml离心管中按下列方式加入：
体积
模板DNA 2μl
Pre-ampmix 1μl
dNTP 1μl
10XPCR buffer 2.5μl
Taq DNA polymease 0.5μl
水： 18μl
离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮。
94℃ 30S， 56℃ 30S， 72℃ 80S
2、用TE buffer 按1:20稀释样品。
四）选择性PCR扩增
1、按需要选择引物对。
2、在0.5ml或0.2ml离心管中，按下列方式加入：
体积(20μl体系)
预扩增稀释样品 2μl
10XPCR buffer 2μl
dNTP 1μl
HindIII 引物 1μl（共8种，按需要挑选一种）
Mse I 引物 1μl（共8种，按需要挑选一种）
Taq 酶 0.5μl
H2O 12.5μl
以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环。
3、1）一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S， 72℃ 80S
2）以后每轮循环温度递减0.7或1℃，扩增12或10轮。
注：递减0.7℃，则扩增12轮，递减10℃则扩增10轮。
3）接着按下列参数扩增23轮
94℃ 30’， 55℃ 30S， 72℃ 80S
五）凝胶分析
1、本步骤试剂均须自备
2、PCR扩增产物：甲酰胺上样液（98%甲酰胺，10mmEDTA，0.25%溴酚兰）8:3 混合，95℃变性8min，然后立即冰浴。
3、制备5%或6%变性胶，变性胶厚度为0.4mm（方便银染）。
4、预电泳恒功率80-90W,约30min，。
5、上样5-7μl样品。
6、恒功率40-50W,电泳至溴酚兰至接近胶底后，停止电泳。
7、银染胶，观察结果。
8、银染方法推荐(见本公司银染试剂盒)
1）10%醋酸固定20-30min，可过夜。
2）蒸馏漂洗2-3次。
3）0.1%硝酸银，0.56%甲醛，染色30min，蒸馏水轻微漂洗数秒。
4）0.28M碳酸钠，0.56%甲醛，200μl硫代硫酸钠(10mg/ml),低温显色5-10min。
5）当条带与背景对比度最清楚时，用10%醋酸终止显色。
6）用蒸馏水漂洗2min。
