试剂盒组成:
1.溶液A 100ml×2 5XSTMT (用时1:4用灭菌双蒸水稀释)
2.溶液B 60ml 5N异硫氰酸胍
3. 溶液C 2.5ml RNase A
4.溶液D 120ml 4N NaClO4 ,pH5.2
5. 溶液E 5ml Resin(用时充分混匀)
6.溶液F 60ml 洗液(用时加入70ml无水酒精,充分混匀)
7.溶液G 25ml TE 缓冲液
实验步骤:
(一)新鲜抗凝血或冷冻抗凝血
1.取3~5ml全血,加入3~5ml 溶液A,温和混匀5~6次(1:1混合)。
2.室温或冰浴10分钟,12000rpm离心20~30秒,弃上清。
注:1)若红细胞溶解不完全,则沉淀物发红,可再加5ml溶液A,重复上述步骤一次。
2)冻存血,则需重复步骤1、2两次。
3.加入1ml溶液B,温和振荡或反复用移液器吸打白色沉淀物4~6次,
4.加入1ml氯仿(自备)抽提。12000rpm,离心5分钟
5.小心吸取上清液,置于另一离心管,加入50μl溶液C,室温放置10分钟。
6.加入2ml溶液D,100μl溶液E,混匀,室温放置5分钟。
7.≥8000rpm离心1分钟,弃上清。
8.加入1ml溶液F,充分混匀,≥8000rpm离心30~60秒,弃上清。
9.重复步骤8。
10.≥12000rpm离心1分钟,吸干剩余液体。室温放置5~10分钟。
11.加入200~400μl溶液G,混匀,50℃保温5-10分钟,≥12000rpm离心1分钟,吸取上清,即为DNA。
(二)分离好的白细胞
1. 1.取100ul白细胞,按1:3的比例直接加入溶液B,充分混匀,加入10μl溶液C,室温放置10分钟。
2. 其余接(一)的步骤4。
注意事项:
1. 用户可视DNA浓度高低,适当调整溶液G的量。若想最大限度提高产量,11歩做完之后,可再加200ul溶液G,重复11歩一次,两次DNA可合在一处。
2. 此方法提取DNA质量非常高,适用于分子生物学任何实验要求,OD260/280≥1.5,一般情况能达到1.7--1.8,若比值偏低,可能是溶血或储存时间过长。
