一、概述：

本试剂盒选择四套简并锚式oligo(dT)MN引物作为锚定引物，在oligo(dT)MN 5′端加一段T₇引物序列M=G/A/C,N=G，A，T，C。具体序列见附一，本试剂盒提供二十种十聚体随机引物，在十聚体随机引物的5′端加上一段M13通用引物，具体序列见附一，差异展示示意图见附二，差异筛选得到的对应于这些mRNA的DNA序列可以回收，克隆，测序以及用于制备杂交或者文库筛选的探针。

二、组成：

10×PCR buffer:   300ul        5×RT buffer:     100ul

dNTP1(1mM):       30ul        dNTP2(0.2mM):    200ul

Taq-plus(2u/ul): 200ul

T₇引物（10pM）:  100ul         M₁₃引物（10pM）:  100ul

T₇T₁₂MG, T₇T₁₂MA, T₇T₁₂MC, T₇T₁₂MT各150ul(10uM)

M₁₃RP 1—20 各50ul(2uM)

H₂O  1.5ml

三、步骤：

1 确保mRNA或总RNA的样品完整，而且不含DNA污染（用Dnase-free RNase，消化mRNA，具体方法见《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，P621-622。）

2 逆转录：

（1）按下列方法建立四套不同的简并oligo(dT)锚定引物（T₇T₁₂MG, T₇T₁₂MA, T₇T₁₂MC, T₇T₁₂MT）

5×RT buffer       4 ul

dNTP1(1mM):        1 ul

总RNA:            0.2 ug(或mRNA0.1ug)

T₇T₁₂MN:             1 ul

加水补足：         19 ul

                **离心数秒混匀。

（2）65℃温育2min，37℃温育5min；

（3）加入1ul M-MLV(RNase H^-)反转录酶，离心数秒，37℃50min；

（4）95℃温育5min灭活反转录酶，稍加高速离心以收集液滴，可立即用于PCR扩增，或贮存于-20℃，用于下面实验。

3 PCR差异显示mRNA：

（1）对于每一套引物按以下方案准备20ul反应液：

   10×PCR buffer:         2ul

dNTP2(0.2mM):           1ul

T₇T₁₂MN:                 1ul

M₁₃十聚体随机引物：     1ul

cDNA(RT产物)：         2ul

Taq-plus:           0.5-1ul

加水补足：             20ul

（2）离心数秒，按下列参数进行PCR扩增：

94℃  预变性  2min

（94℃  变性   30秒

40℃  复性    20秒

72℃  延伸    60秒）循环40轮

72℃  延伸加时 10min

4 PCR电泳

（1）     制备6%聚丙烯酰胺变性凝胶

（2）     取3-5ulPCR产物加等体积甲酰胺加样缓冲液（2*loading buffer）, 95℃ 2min

（3）     立即冰浴，离心数秒，将样品上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶，60W电泳2-3小时。

（4）     银染观察，DNA片段差异，并将差异带回收，以便进行以后的实验。

·试剂盒说明：

1 RNA样品数不要太多，以2-4个为宜。

2 逆转录时每个RNA样品均需分别使用4套oligo(dT)简并引物。

3 PCR扩增时，随机引物有二十种，不必要一次做完，每个样品PCR扩增时均需设2-4个平行样。

4 差异展示能展示差异基因的表达与否或表达高低不同，但假阳性极高，因此实验过程中应非常小心，另得到差异片段后，均需经过 Dot blotting(反Northern)验证。

5 本试剂盒提供的锚定引物和随机引物具有如下优点：

（1）    差异带回收后可直接用T₇和M13引物重新扩增增加产量。

（2）    差异带经确认后，不需克隆，可直接用T₇或M13引物进行测序。

附录一：

锚定引物：     

T₇T₁₂MA： 5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTT（A/C/G）A  3′

                    T₇

T₇T₁₂MC  5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTT（A/C/G）C  3′

T₇T₁₂MG  5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTT（A/C/G）G  3′

T₇T₁₂MT  5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTT（A/C/G）T  3′

随机引物：

M13RP1：5′  ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG   3′

M₁₃

M13RP2： 5′  ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGG   3′

M13RP3： 5′  ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGG   3′

M13RP4： 5′  ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGAC   3′

M13RP5： 5′  ACAATTTCACACAGGAATGGTAGTCT   3′

M13RP6： 5′  ACAATTTCACACAGGATACAACGAGG   3′

M13RP7： 5′  ACAATTTCACACAGGATGGATTGGTC   3′

M13RP 8：5′  ACAATTTCACACAGGATGGTAAAGGG   3′

M13RP9： 5′  ACAATTTCACACAGGATAAGACTAGC   3′

M13RP10： 5′  ACAATTTCACACAGGAGATCTCAGAC   3′

M13RP11： 5′  ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTGT   3′

M13RP12：5′  ACAATTTCACACAGGAGGTACTAAGG   3

M13RP13： 5′  ACAATTTCACACAGGAGTTGCACCAT   3′

M13RP14： 5′  ACAATTTCACACAGGATCCATGACTC   3′

M13RP15： 5′  ACAATTTCACACAGGACTTTCTACCC   3′

M13RP16： 5′  ACAATTTCACACAGGATCGGTCATAG   3′

M13RP17： 5′  ACAATTTCACACAGGACTGCTAGGTA   3′

M13RP18： 5′  ACAATTTCACACAGGATGATGCTACC   3′

M13RP19： 5′  ACAATTTCACACAGGATTTTGGCTCC   3′

M13RP20： 5′  ACAATTTCACACAGGATCGATACAGG   3′

附录2：

差异展示的示意图。凝胶图谱表示用一套引物对两种类型细胞A和B扩增结果。虚线代表RNA；T₁₂MN表示简并oligo(dT)引物；M表示A、C、G（简并）；N可以是A、C、G、T。